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誰でもできる！ImageJによる4Dデータの画像処理
本サイトではImageJを用いた、4Dデータの画像処理法を扱っています。
4Dデータは3Dスタックが時間軸で連続するため、画像処理の作業量が膨大になりがちです。しかしImageJのマクロ機能を使うことで、単純な繰り返し作業から解放されます。また各種プラグインを用いることで半自動で画像内の組織の動きをキャンセルしたり、ノイズを取り除いたり、時間ごとにブレる明るさを均一化でき、手作業と比べて画像処理作業が格段に速くなります。さらにこうした自動画像処理法によって、これまで論文や発表では使えるレベルではなかったデータセットも利用可能になり、結果として実験回数を減らせ、データを効率的に得ることができるようになります。
解説ムービー
画像処理法のプレゼンテーションスライド
ImageJを用いた4Dデータの画像処理法の講義スライド。スライド間隔を5秒に限定して、クイックタイムムービー化したものです。タイムスライドバーで見たいスライド位置に瞬時に移動可能。しかしスライド内のムービーが5秒以上なのでそれらは駒落ちします。
高解像度版（1024ピクセル・15メガバイト）
低解像度版（ 512ピクセル・4メガバイト）
手動クリック式のプレゼンテーションスライド
同じ内容ですが、画面をクリックすることで次のスライドアクションに進めます。スライド内のムービーの駒落ち無し。しかしタイムスライドバーが無いので、見たいスライド位置を出すことができません。
高解像度版（1024ピクセル・19メガバイト）
低解像度版（ 512ピクセル・5メガバイト）
本サイトに置いてあるファイルの内容について：
本サイトにあるファイル群はこちらからdownload
"ImageJ"
ImageJ_Ver1.38 & 1.41j
現在（2008,Aug）ImageJのダウンロードサイトから配布されているバージョン (1.40) はRGBマージにバグがあるため、それらのバグが無い1.38 or 1.41jの使用を薦めます。
1.41jについて：http://rsb.nih.gov/ij/notes.html
1.41jはまだ正式にダウンロードサイトに載っていないため、念のため過去に正式バージョンであった1.38も本サイトに置いておきます。（1.41jはRGB+グレーで4色表示が可能、1.38はできない。）
1. 始めに、ImageJダウンロードサイトでImageJをダウンロード
http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html.
2. 展開したImageJフォルダの中のij.jarに対して、本サイトにある ImageJ_Ver1.38 又は 1.41jの中身を上書きする。
3. 本サイトにあるPluginsの中身を、展開したImageJ/Plugins/内にそのままコピーする。
（注：Pluginsフォルダをコピーするのではなく、Pluginsフォルダの中身のみ）
4. ImageJアプリケーションをダブルクリックで起動。
5. ファイルメニューの Edit→Options→Memory & Theread を選び、使用メモリー量を増加させる。（Max1450MB, それ以上にするとImageJが起動しなくなる。）
"ImageJマクロ"
マクロの走らせ方
マクロのTEXTファイルをImageJで開き（ImageJウィンドウの下側のバーにドラッグ&ドロップしても開ける）、マクロのテキストウィンドウをクリックして前面に出した状態で→ファイルメニューのMacros→Run Macro を選択。
注意点：ImageJのバージョンが1.35以前だとマクロが動かない場合が多い。
z-projection_from_original.txt (_3x3medianは平均化フィルター処理アリVer.)
leica、olympus、zeissなどのコンフォーカルの元ファイルから、複数のチャンネルを自動認識し、チャンネルごとに異なるフォルダにprojected.tiffを保存する。本マクロはプラグインを介して各メーカーの元ファイルを読むが、それが遅い（後に解決法を述べる）。タイムポイントが多く、何度も異なるz-sectionでprojectionしたい場合はマシンパワーにもよるがかなり時間がかかる。しかし1度のみのprojectionでよければ、このマクロの方が後で述べるマクロと比べると手数が少ないために簡便。また、読み込みに用いているプラグインがチャンネルを3から1へ読むため、作成フォルダの名前も3から1へとなっている。そのため、1チャンネルではフォルダ3のみ、2チャンネルではフォルダ3, 2が出来る。
使用法：
yyy = 0; zzz = 100; //projection from yyy to zzz, zzzを100にすると、100枚以下のスライス全てをprojection
//を行の先頭に付けると、その機能をオフにできる。本マクロではMaxとAverage projectionの切り替えに使っている
作動時の注意：
マクロで指定したフォルダにコンフォーカルのメーカー製画像以外のファイルを置かない。（フォルダは自動認識してスキップする）
動作後は、出現した各フォルダをImageJにドラッグ&ドロップ、stackとして開く
projected.tiffのRGBマージはImage→Color→Marge Channels (Ver.1.41j), Image→Color→RGB Merge (Ver.1.38)でできる。
03z-projection_from_8bitTIFF.txt
8-bitのマルチレイヤーTIFFからprojection.tiffを作る。動作は高速。なので私は「メーカーのコンフォーカルファイル→8bitにコンバート→それをprojection」としています。またメーカーファイルが12 or 16bit だった場合、8bitに変換して元ファイルをHDDから削除することで大幅に容量を節約できます。
従ってマクロ使用の順序としては以下のようになります。
01Save_8bit_multiCH.txt（メーカーのコンフォーカルファイルを、チャンネルごとの8bitのマルチレイヤーTIFFにコンバート、 _3x3medianは平均化フィルター処理アリVer.）
02RGBmerge.txt（チャンネルをRGBマージしたマルチレイヤーTIFFの作成、現在は2チャンネル用。）
03Z-projection_from_8bitTIFF.txt（02で作ったマルチレイヤーTIFFをprojection）
"Plugins"
Hybrid 2D Median Filter, Hybrid 3D Median Filter
http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/hybrid2dmedian.html.
http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/hybrid3dmedian.html.
ノイズリダクションに効く平均化フィルター。ダウンロードした後に、ファイルメニューから Plugins→Compile & Run を選び、Hybrid_2D_Median_Filter.javaを選択してコンパイルする。（Hybrid 3D Median Filterも同様）
loci tools
http://www.loci.wisc.edu/ome/formats.html
様々な種類のファイルをImageJで読めるようにするプラグイン。現在配布されている最新版では、マクロでの動作時にバグがあったため、本サイトにはバグが無い古いバージョンをおいてあります。
StackReg
http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
連続画像内のオブジェクトの動きを、キャンセルする。StackReg単体では動作せず、TurboRegというプラグインも必要になります（本サイトに有り）。
Interpolating_Normalizer
連続切片内のヒストグラムを、始めと最後のスライド間で揃えることで、画像の明るさを均一化。このプラグインはこれまで正式に配布されていませんでした。本サイトのみでの配布になります。制作者は東大・新領域・高次構造研究分野の四宮和範さん（2008年度でD2）です。
注意点：始めと最後の間でヒストグラムを揃えるので、途中でシグナル領域の面積が大幅に変わると機能しません。
（現在、特定スライス間のみでの明るさ均一化が可能なVer.2も作成中。。。本人はバグがあるので配布するつもりは無いと言っていますが、もしこちらのバージョンも欲しい方は大綱まで "Interpolating_Normalizer Ver.2が欲しい" とメールをいただけると、ひょっとしたら、、、）
謝辞：
サンプルデータを提供していただいた
Arminda Suli 様(Univ. of Utah Neurobiology & Anatomy)“血管形成データ”
Mei-Yee law 様(Univ. of Utah Neurobiology & Anatomy) “RGC伸張データ”
Interpolating_Normalizerを提供していただいた。
四宮和範 様（東大・分生研・高次構造研究分野）
本ページの作成者：
大綱英生（おおつなひでお）（Univ. of Utah Neurobiology & Anatomy）
メールアドレス
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