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胚にインジェクションするときのプラスミド調製
Date: Thu, 24 Feb 2000 21:56:56 +0900
From: tmurataアットマークrtc.riken.go.jp (Murata, RIKEN Tsukuba)
Subject: [Jfly] Plasmid prep for P mediated transformation.
村田アットマーク理研つくばです。
pUASTをembryoにinjectionするときに、CsClやカラムでscDNAを
調製してからですが、教えてください。
1. なぜそうしなければいけないのか？
2. アルカリ法で粗調製したplasmidではだめなのか？
//
Takehide MuraTa Ph. D.
e-mail: tmurataアットマークrtc.riken.go.jp
personal HP: http://www.geocities.co.jp/Technopolis/2002/
phone: +81-298-36-3612, fax: +81-298-36-9120
Tsukuba Life Science Center,RIKEN
Tsukuba Science City, Ibaraki 305-0074, Japan.
>>>> Japanese Address <<<<
村田 武英，研究員
305-0074 茨城県 つくば市 高野台 3-1-1
理化学研究所 ライフサイエンス筑波研究センター
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Date: Fri, 25 Feb 2000 19:56:36 +0900 (JST)
From: huedaアットマークlab.nig.ac.jp (Hitoshi Ueda)
Subject: [Jfly] Plasmid prep for P mediated transformation.
遺伝研、上田です。
>pUASTをembryoにinjectionするときに、CsClやカラムでscDNAを
>調製してからですが、教えてください。
>
>1. なぜそうしなければいけないのか？
>2. アルカリ法で粗調製したplasmidではだめなのか？
>
2. について
うちでは、最近は、アルカリ法（クラボウのプラスミド調整機）でとったプラスミド
をNH4OAc沈澱、RNaseA処理、ProteinaseK処理、PEG沈澱、Phenol-Chloroform抽出、
エタノール沈澱の順で精製して、インジェクションバッファーに溶かしたあと、Mill
iporeのサンプレッサー４（Ｔ）ーＨＶで濾過して使っていますが、問題はありませ
ん。インジェクションは、エタノール法でやっていています。針の違いがあるので、
CsClやQIAGENカラムで精製したものとの違いは、比較できませんが、効率が悪いとい
う印象は、ありません。、２サイクルもやると、いやというほど赤目のはえが出てく
ることもあります。もっと精製をさぼれるかどうかは、ためしていません。
上田 均
国立遺伝学研究所
形質遺伝研究部門
〒411-8540静岡県三島市谷田１１１１
TEL：0559-81-6774
FAX：0559-81-6776
email：huedaアットマークlab.nig.ac.jp
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Date: Fri, 25 Feb 2000 20:12:13 +0900
From: "ITO, Kei"
Subject: [Jfly] Plasmid prep for P mediated transformation.
> 村田アットマーク理研つくばです。
>
> pUASTをembryoにinjectionするときに、CsClやカラムでscDNAを
> 調製してからですが、教えてください。
>
> 1. なぜそうしなければいけないのか？
・mRNA やタンパクの混入を最小限に抑えたい。
・キアゲンみたいなカラムだと、プラスミド DNA に微小なニックが入って
しまい、効率が落ちるのであまり良くない。
という理由から、出来れば２回 CsCl で遠沈するのが一番いい、と昔言われ
ましたが、本当にこういう理由なのかは確認したことがありません。
> 2. アルカリ法で粗調製したplasmidではだめなのか？
これはパス。上田さんの話を読ませていただくと、mRNA やタンパクを酵
素処理で除くのでも、うまく行くみたいですね。
いとうκ
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Date: Mon, 28 Feb 2000 18:13:48 +0900 (JST)
From: njuniアットマークmn.waseda.ac.jp (Naoto JUNI)
Subject: [Jfly] Plasmid prep for P mediated transformation.
早稲田大学 山元研究室、従二です。所属変わりました。
> 村田アットマーク理研つくばです。
>
> pUASTをembryoにinjectionするときに、CsClやカラムでscDNAを
> 調製してからですが、教えてください。
>
> 1. なぜそうしなければいけないのか？
> 2. アルカリ法で粗調製したplasmidではだめなのか？
確かに教科書にはCsClやカラムで精製しろとは書いてあっても、「何のために」とい
う事を明確に論じているものは見たことがありません。話としては、Supercoiledで
なければ形質転換効率が悪いからだとか、RNAやタンパク質のコンタミが何か悪影響
を及ぼすからだ、といった見解は耳にします。しかし、高純度精製が要求される真の
理由であると私が信じるのは、粗精製では除去できない大腸菌由来の毒素（endotoxi
n、リポ多糖）や残留する毒性のある試薬（SDSなど）を取り除き、embryoのダメージ
を防ぐということです。
トランスフォーメーションを初めて手がけた頃に、泳動でチェックしてSupercoiled
がきれいに取れているなら通常のアルカリ/SDS法だけでも十分だろうと考えて、それ
以上の精製を省いてしまったことがありましたが、とにかく孵化率が悪すぎて実用的
でありませんでした。これは、プラスミド調製をCsCl法にしただけで劇的に改善され
た記憶があります。厳密な比較実験をしたわけではありませんので、ごくおおざっぱ
な話ですが、CsClで精製したプラスミドをインジェクションした場合、悪くても5割
くらいの個体は生き残るのに対し、アルカリ/SDS法で精製しただけ場合、生存率は数
％かそれ以下でした。ただし、生き残りのうち、形質転換体を生じる個体の頻度は、
精製法にかかわらず1割から2割といったところで変わりありませんでした（粗精製で
も、数百から数千のembryoに打てば、数十個体が生き残り、その中からなんとか形質
転換体が得られる...）。精製度は形質転換効率に影響するというより、注射されたe
mbryoの生存率に大きく影響するファクターだと思われます。
一方、特にサイズの大きいプラスミドなどは、精製の過程や保存中に、大部分がOpen
Circularになってしまうということもありますが、それでも形質転換体の出現頻度が
ことさら下がったという印象はないので、Supercoiledであることがそれほど重要だ
とは思えません。
世にプラスミド精製キットはたくさんありますが、その中には、endotoxinをいかに
よく除去できるとか、transfectionに使用した場合、細胞の生存率がどれほどいいか
などを売りにしているものも多い（またそれらはどれも、CsCl法と同等の純度をうた
っている）ということから考えても、うなずける話ではないかと思います。うちは最
近はもっぱらQIAGENです。
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従二 直人（じゅうに なおと）
早稲田大学人間総合研究センター 東伏見バイオ実験室 山元研究室
〒202-0021 東京都保谷市東伏見2-7-5
TEL: 0424-50-5824 FAX0424-50-5825