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ノーザン・ブロットについて
Date: Fri, 11 Apr 2003 10:48:33 +0900
From: "粂 和彦"
Subject: [Jfly] ノーザン・ブロットについて教えてください
熊本大学の粂です。
超初心者の質問で申し訳ないですが、液体窒素で凍らせて取った頭部のＲＮＡのノー
ザンで、２点疑問がありますので、経験のある方教えてください。
１．トータルＲＮＡを流したとき、ＥｔＢｒ染色で巨大なバンドが１本見えて、その
上下にうすいバンドが見えるのですが、これらは何でしょうか？哺乳類だと、２８Ｓ
と１８Ｓが、２対１くらいの比で見えるので、不安になってます。
２．三浦さん経由で頂いたｒｐ４９のプローブをポジコンに使ったのですが、トータ
ルＲＮＡと、ポリＡプラスＲＮＡで、高さが異なるのです。これも経験したことが無
かったので、なんでかな？と。首をひねっています。
すいませんが、よろしくお願いします。
熊本大学発生医学研究センター
再建医学部門 幹細胞制御分野
助教授 粂 和彦
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Date: Fri, 11 Apr 2003 11:58:55 +0900
Subject: [Jfly] Re: ノーザン・ブロットについて教えてください
From: Shuji Hanai
花井＠筑波大です
昔、こんな話題が有りましたね。もう６〜７年も前になるのですね、、、
http://jfly.nibb.ac.jp/html/discussion/1996/9611_Drosophila_28S_RNA.html
つまり１本が正しい。という事でした。
JFlyのアーカイブやマニュアル等には大変お世話になっております。まとめて下さっ
ている伊藤先生有り難う御座います。
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Date: Fri, 11 Apr 2003 12:15:22 +0900
From: Yoshiharu Tanaka
Subject: [Jfly] ノーザン・ブロットについて教えてください
粂先生
高分子で発現量が少ないといわれているNa channel mRNAをNorthenで再現性良く検出しようとしています田中です。
1. hidden breakの件は花井先生にお答えいただいてますので、うすいバンドのことで。
mRNAを流した時、一番濃いバンドは1400 bp辺りで、混入しているrRNA (約2000b)の下に出ますので、それのことだと思われます。
2. タンパク質やDNAの電気泳動では、ある長さの分子が大量にある場合、minorな分子の 移動度は本来の移動度からずれることをよく経験しています。total RNAにはrRNAが大部分を占めますので同様の事が起こっていると思います。。
田中 良晴
大阪府立大学総合科学部自然環境科学科
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Delivered-Date: Fri, 11 Apr 2003 12:48:52 +0900
From: Kaoru Saigo
Subject: [Jfly] ノーザン・ブロットについて教えてください
経験者というわけではありませんが、１．は２８Ｓの真ん中にニックが有ることに依
拠しております。これは、随分前（私の記憶が正しければ１９７７年前後）に、東大
にいた石川さんが、NARに論文を書いていますが、ハエを含めた昆虫に特徴的なこと
で、このため、28S ribosomal RNA と18S ribosomal RNAが重なります。哺乳類と異
なっていて結構です。２．はバンドの位置に依りますが、トータルRNAには、大量のr
ibosomal RNAがあるために、それにより他のRNAが”押しのけられ”mobilityが変わ
ったり、ribosomal RNAにより直ぐ上（あるいは下）に押しのけられた、本来バラバ
ラの長さの壊れたRNAが偽のバンドをつくったりします。polyA RNAでは、この様な
事は起こりませんので、こちらのデータを信じて進まれるのがより適切かもしれませ
ん。 西郷 薫
Kaoru Saigo
Department of Biophysics and Biochemistry,
Graduate School of Science,
University of Tokyo,
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Date: Fri, 11 Apr 2003 16:40:24 +0900
From: "粂 和彦"
Subject: [Jfly] ノーザン・ブロットについて教えてください
花井先生、田中先生、西郷先生
早速のコメントを、どうもありがとうございました。とてもよくわかりました。
＃ １８Ｓと２８Ｓがほぼ同じ場所に流れてしまうのですね・・・rp49は、total RNA
では、このRNAの大きなかたまりのすぐ下に泳動されますが、polyA+では、かなり短く
泳動されます。多少の差なら経験があったのですが、１０％くらいはっきりと異なる
ので、ちょっと変だなあと思っていました。
＃ また私が見ている変異体では、total RNA で見ると、あるRNAがなくなっていたの
ですが、polyA+ では、野生型より短くなったものが、しっかり検出できました。
これも、ちょうど、その短くなった場所が、18S(+28S)の場所に重なるので、うまく
転写されないためのようです。
熊本大学発生医学研究センター
再建医学部門 幹細胞制御分野
助教授 粂 和彦