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抗 beta-gal 抗体は、どこの会社のがいいか？
Date: Fri, 30 Jun 1995 20:08:01 +0900
From: kazueアットマークfly.erato.jrdc.go.jp (Kazue Usui) (by way of itokeiアットマークfly.erato.jrdc.go.jp (ITO, Kei))
Subject: [Jfly] anti-b-gal Ab staining
新技団の薄井と申します。山元projectにおります。
新しいメールシステムが順調に動いてくれてうれしいです。（昔とったなんとやらで
rootをやらされています）
これから色々とご相談すると思いますが、よろしくお願いします。
早速ですが、先日上村さんには啓さんのほうからご相談したのですが・・・
うちではα-βgalの抗体染色がうまくいきません。
cappel社製の抗体はLot No.の違うものを２種類試したのですがいずれも、非常に感
度がひく低く、X-galでかなり強い発現が見られる系統でも抗体染色では発現が見ら
れません。（濃度は1：500 です）
上村さんから５年もののCappel社製の抗体をわけて頂きましたので、それと、Promeg
a社製の抗体を買って早速試してみる予定ですが、
最近α-βgal抗体を買われて、良い結果を得ていらっしゃる方や、何か良いアドバイ
スが頂けたらうれしいです。
では、皆様良い週末を！
薄井一恵
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Date: Fri, 30 Jun 1995 20:08:36 +0900
From: tanrcbアットマークmbox.nc.kyushu-u.ac.jp (Teiichi Tanimura) (by way of itokeiアットマークfly.erato.jrdc.go.jp (ITO, Kei))
Subject: [Jfly] anti-b-gal Ab staining
At 6:24 PM 95.6.23 +0900, Kazue Usui wrote:
>うちではα-βgalの抗体染色がうまくいきません。
>cappel社製の抗体はLot No.の違うものを２種類試したのですがいずれも、非常に感
>度がひく低く、X-galでかなり強い発現が見られる系統でも抗体染色では発現が見ら
>れません。（濃度は1：500 です）
>最近α-βgal抗体を買われて、良い結果を得ていらっしゃる方や、何か良いアドバイ
>スが頂けたらうれしいです。
私のところでは、最近Promega(lot 32500)を用いて、Gaul et al. Cell 68(6), 1007
-1020 (1992)の方法で行いましたが問題はありませんでした。抗体は1/1000 dilです
。感度は、O/N X-Gal染色より少し低いほどです。
九州大学理学部生物学教室 細胞機能学講座 谷村 禎一
810 福岡市中央区六本松4-2-1
092-771-4161 内433 FAX 092-712-1587
tanrcbアットマークmbox.nc.kyushu-u.ac.jp / tanimuraアットマークrc.kyushu-u.ac.jp
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Date: Fri, 30 Jun 1995 20:14:03 +0900
From: Motojiro YOSHIHARA(KoudoSeiri) (by way of itokeiアットマークfly.erato.jrdc.go.jp (ITO, Kei))
Subject: [Jfly] anti-b-gal Ab staining
薄井さん
抗ベータgalでトラブっているとのこと、
この前いとけい氏にお知らせしたと思うのですが、「発生・分化・老化」に松崎さん
が書かれているChemiconのヤツはうまくいきますよ。もしご希望なら1-2年ものの
抗体を送りますが。濃度は1/1000でうまくいきます。
では、good luck！
群大行動生理 吉原基二郎
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Date: Thu, 6 Jul 1995 15:33:47 -0800
From: sgotoアットマークlab.nig.ac.jp (Satoshi Goto)
Subject: [Jfly] bGal staining
こんにちは、国立遺伝学研究所の後藤です。
皆さん話題のbGal Abのことですが、結局どこの製品がベストだったのでしょうか？
私は、蛍光ラベルの二次抗体で検出したいので、できるだけ強いシグナルを取れるマ
ウスの抗体（二重染色の都合）が欲しいのですが。薄井さん、いかがでしたか？教え
ていただけると助かります。
では、
後藤聡
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Date: Fri, 7 Jul 1995 19:05:53 +0900
From: kazueアットマークfly.erato.jrdc.go.jp (Kazue Usui)
Subject: [Jfly] bGal staining
御指名ありがとうございます。山元プロジェクトの薄井です。
質問だけをぶつけておいて、その後の報告を怠りました事をお詫び申し上げます。
bGal antibodyについてですが、cappel社製,（rabbit poyclonal）の抗体を、新しく
買った二種（Lot No.55699,55976)と上村さんにいただいた５年ものの抗体、Promega
のmouse monoclonal(Lot No. 49309)を比べてみました。いずれも２次抗体はBitin-c
onjugateでABCキットを使用しています。
結果は,Promegaが最も良く染まりました。上村さんに頂いた５年物のCappelは新品
よりも良く染まりましたので、最近のCappelはあまり良くなりようです。rabbitのpo
lyclonalがいまひとつでmouse monoclonalが良さそうなので,2次抗体のチェックもし
てみました。
比べたのは手持ちのCappelのanti-rabbit IgG whole（Lot No. 38427)とvectastai
nのanti-rabbit IgGです。がこちらはあまり差がありませんでした。
こちらは二重染色も考えるとrabbitでいきたかったのですが、当分先なのでしばら
くはPromegaでいこうと思います。（うちのProtocolに問題があるのかもしれませんが）
後藤さんはマウスの抗体とのことですからPromegaで問題ないと思います（他は試し
ていませんが）。
谷村さんからお知らせ頂いたPromegaとはLot. No.が違いますが（谷村さん：32500）
こちらでも染まりましたのでCappelのようなことは無いと思います。
やっとbGal染色ができるぞと思った時にはすでにハエはなく、もう一度かけなおしを
しました。また何か抗体染色に関して良い情報がありましたらご指導下さい。
以上、遅くなりましたが御報告まで。
薄井一恵
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Date: Sat, 8 Jul 95 12:38:26 JST
From: Motojiro YOSHIHARA(KoudoSeiri)
Subject: [Jfly] bGal staining
群馬大吉原より新技団薄井さんへ 1995年7月8日
話題のbGal stainingについてですが、
少し混乱されているようですが、No.55976というのはcatalog No.で、lot No.では
ありません。私が現在使用していてうまくいっているものは（以前にprivate mailで
いとけい氏にお知らせしたものですが),
Cappelのcatalog No.55976で、lot No.が35601のものです。
薄井さんが最近試されて「良くなかった」というものは、catalog No.、lot No.が
いくつのものですか？次に買うときにうまくいかないと困りますので。
再びご指名です。
群馬大学行動生理 吉原基二郎
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Date: Sat, 8 Jul 1995 17:10:49 +0900
From: noseアットマークnibb.ac.jp (Akinao Nose)
Subject: [Jfly] bGal staining
はじめてこのネットに投稿します、基生研の能瀬です。このネットが開設して以来楽
しく拝見しています。伊藤啓さんをはじめとして、このネットの開設に尽力された方
に感謝いたします。
さて、抗 beta-gal 抗体に関してですが、私たちの研究室ではpromega のmouse MAb
とCappel の rabbit PAb を併用していますが、どちらもうまくいっています。た
だ感度を比較するとCappel の rabbit PAb の方がずっと良好です。したがって強
い発現を検出する際はpromega のMAbを使っていますが、弱い発現を見る必要がある
ときにはCappel を使うようにしています。これは結構criticalで例えば、サブセッ
トのニューロンで発現するエンハンサートラップラインを染めた際、はっきりとポジ
とわかる細胞の数が大きく違ってきます。
薄井さんの比較によると、promega の方が良かったということですが、Cappel の ra
bbit PAb を使用する際、preabsoption をやっておられますか。私たちは、まず過剰
量のembryoで吸収を行ってから染色に用いています。これをやらないとバックが高く
なり結果として一見感度が低いように見えるという可能性があります。もしpreabsop
tion をやっていてもダメなのなら最近のバッチが悪いということでしょうが、そう
だととしたら困ったことです。
能瀬聡直
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Date: Sat, 8 Jul 1995 14:45:06 -0800
From: sgotoアットマークlab.nig.ac.jp (Satoshi Goto)
Subject: [Jfly] bGal staining
我々のところでは、Promega (lot.325003)を使っているのですが、蛍光ラベルの二次
抗体ではかなり弱くて使用に耐えません。二次抗体はChemiconのanti-mouseIgG-Cy3
（lot.304JEI13)です。どなたかmouseAbで二次抗体レヴェルでうまくいっている方は
いらっしゃいませんか？または、三次抗体まで使っている方はいらっしゃいませんか
？情報があれば教えてください。
後藤聡
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Date: Sun, 9 Jul 1995 18:58:50 +0900
From: uemuraアットマークvirus.kyoto-u.ac.jp
Subject: [Jfly] bGal staining
京大の上村です。
昨日の能瀬さんのご意見と全く同感です。
>さて、抗 beta-gal 抗体に関してですが感度を比較するとCappel の
rabbit PAb の方がずっと良好です。
Cappel の rabbit PAb （５年近く使っているもの）を 1: 2000 から 1:5000 で
一晩インキュベートし、ビオチン抗ウサギ（Amersham）を 1:500 から 1:1000
で一時間半程度、さらにエリート ABC を A液、B液それぞれ 1:100 か 200 で混
ぜて使ってます。これはそもそも伊藤さんや松崎さんに教えてもらった方法だと思
います。つい先週も染色しましたが、シグナルは問題なく得られました。
一次抗体は1:5000 くらいのほうが、バックが低くなりよりきれいな染色ができる
ようです。もちろん胚が少なすぎると、バックは出やすくなります。ただし、並行し
て enhancer trap line を何系統か染めると、（どの系統の胚の量は同じなのに）
どういうわけかバックが出てしまう株はあります。ちなみにこちらでは、今は
一次抗体の preabsoption はやっていません。
Promega のモノクロの感度の低さにはいらつくことが多くて、最近は全く
使っていませんでした。
>もしpreabsop
>tion をやっていてもダメなのなら最近のバッチが悪いということでしょうが、そう
>だととしたら困ったことです。
これは極めて由々しき問題です。
上村匡
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Date: Sun, 9 Jul 1995 22:08:13 +0900
From: itokeiアットマークfly.erato.jrdc.go.jp (ITO, Kei)
Subject: [Jfly] bGal staining
伊藤啓です。いろいろご経験を教えていただき、ありがとうございます。
抗 beta-gal 抗体は元来私も Cappel 派でして、ドイツでもずっと Cappel Pab
を使っていて、うまくいってました。まじめにやるときは preabsorpiotion も
してましたが、しない場合もありました。
こちらで Cappel を買ったら非常に薄くしか染まらなくて、バッチのせいかと思っ
て違うバッチのをアメリカから業者に取り寄せてもらって計２つ試したのですが、
それでもうまくいかなくて、現在にいたっているわけです。
上村さんの抗体はうちで試した独立の２つのバッチよりも調子がよいので、最近
の Cappel は品質が落ちたのではないかという「ゆゆしき事態」を危惧していま
す。
薄井の結果の通り、Dark horse の Promega が意外によく染まり、上村さんの
５年ものよりも調子がよかったのですが、これはただバックが高いという意味だ
けでなく、染まっている部位の濃さも Promega の方が優っていました。
Preabsorption をしない場合、ただ高いバックのせいで感度が落ちて見えるだ
けでなく、拮抗作用か何かで実際に感度が落ちる、ということはあるのでしょう
か？
Pab がうまく染まらないのは、もしかしたら Cappel と組み合わせてうちでいま
使っている biotinilated goat anti rabbit 二次抗体が良くないのかもしれませ
ん。薄井のメールの通り Cappel と Vectastain はどちらも同じ程度でした。私
はドイツでは Dianova のを使っていましたが、日本では購入先が分からず、試し
ていません。 上村さんのメールにある Amersham はまだ試していません。この
二次抗体は他の方の経験はどうでしょうか？
（モノクロ用の Vectastain の二次抗体は他の抗体でも使っていて上手く染まっ
ているのですが、兎ポリクロ用の抗体は Cappel 抗 beta-gal しか組み合わせて
染めていないので、比較が出来ていないのです。）
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Date: Mon, 10 Jul 1995 09:23:45 +0900
From: shayashiアットマークlab.nig.ac.jp (Shigeo Hayashi)
Subject: [Jfly] bGal staining
みなさんの熱気にあおられて投稿します。
lacZに関する情報ですがpromegaのモノクロはそもそも悪いものではありませんでし
た。以前私がアメリカで使ったり、日本に来てから五年前に購入したものは１０００
倍希釈、二次に抗マウスbiotinラベル５００倍（アマシャムだったと思う）でABCeli
teの組み合わせで文句はありませんでした。しかし最近３年間で２回異なるバッチを
試したところ全然悪くなってしまいました。promegaはクレームの対応も悪く今後良
いモノクロが見つかればあまり利用したくはありません。シグマとベーリンガーでモ
ノクロを出しているのでこちらに期待したいのですがどなたか使用された方の情報が
あれば助かります。
………………………………………………………………………………………………………
Shigeo Hayashi
National Institute of Genetics
Mishima Shizuoka-ken 411 Japan
phone 81-559-81-6823
fax 81-559-81-6825
e-mail shayashiアットマークlab.nig.ac.jp
林 茂生
国立遺伝学研究所
〒411 三島市谷田111-1
電話 0559-81-6823
fax 0559-81-6825
電子メール shayashiアットマークlab.nig.ac.jp
………………………………………………………………………………………………………
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Date: Mon, 10 Jul 1995 11:16:04 +0900
From: kazueアットマークfly.erato.jrdc.go.jp (Kazue Usui)
Subject: [Jfly] bGal staining
吉原様
あわてて書いてしまい、申し訳ありません。
>薄井さんが最近試されて「良くなかった」というものは、catalog No.、lot No.が
>いくつのものですか？次に買うときにうまくいかないと困りますので。
Cappel:(catalog No. 55976 Lot No.39716),(catalog No. 55976 Lot No. 38952)の
二種です。
先のメールで啓さんも書いていますが、御指摘の通りpreabsorptionは行っておりま
せん。バックが高い点を差し引いても、発現の強い部分ではCappelもPromegaも変わ
りませんが発現の弱い部分では明らかにPromegaの方が良かったのです。（これは私
の眼だけでなく複数の人に確認してもらいました。）
また、何度か使い回した抗体を用いても（バックは低くなりますが）Promegaで見え
る発現がCappelでは確認できませんでした。
もしかするとあたりのPromegaをひいたということだけなのかもしれません。
こちらでは、成虫の脳の染色で比較をしているのですが、embryoで染まって脳では
ダメということはありませんよね。
新技団 山元プロジェクト
薄井一恵
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Date: Mon, 10 Jul 1995 13:40:53 +0900
From: noseアットマークnibb.ac.jp (Akinao Nose)
Subject: [Jfly] bGal staining
林さんの質問に関して
>シグマとベーリンガーでモ
>ノクロを出しているのでこちらに期待したいのですがどなたか使用された方の情報が
>あれば助かります。
２年前になりますが、プロメガ、シグマ、ベーリンガーを同時に比較したことがあり
ます。その時の結果は、プロメガが一番良く、ベーリンガーがそれに比べ同じぐらい
か、やや劣る感じ、シグマはかなり劣るというものでした。ちなみにこのときoncoge
ne science 社の物も安かったので、試してみましたが全然ダメでした。バッチごと
に品質が異なるということがあるのなら、現在販売されているものでは結果が異なる
かもしれませんが、御参考までに。
基生研、能瀬聡直
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Date: Mon, 10 Jul 1995 14:13:29 +0900
From: okabeアットマークigaku.md.tsukuba.ac.jp (岡部正隆)
Subject: [Jfly] bGal staining
初めまして筑波大 岡野研の 岡部 と申します。
>Pab がうまく染まらないのは、もしかしたら Cappel と組み合わせてうちでいま
>使っている biotinilated goat anti rabbit 二次抗体が良くないのかもしれませ
>ん。薄井のメールの通り Cappel と Vectastain はどちらも同じ程度でした。私
>はドイツでは Dianova のを使っていましたが、日本では購入先が分からず、試し
>ていません。 上村さんのメールにある Amersham はまだ試していません。この
>二次抗体は他の方の経験はどうでしょうか？
>（モノクロ用の Vectastain の二次抗体は他の抗体でも使っていて上手く染まっ
>ているのですが、兎ポリクロ用の抗体は Cappel 抗 beta-gal しか組み合わせて
>染めていないので、比較が出来ていないのです。）
私は以前からCappelの抗beta-gal（1:1000)を用いてembryoを染色しています。２次
抗体はJakson's Lab.の抗rabbit IgG-HRP conj.を1:500-1:1000で用いています。ABC
kitではありませんが、非常に良く染まるのと手間がすくないのでこの方法でずっと
やっています。
参考までに
岡部正隆
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Date: Mon, 10 Jul 1995 17:09:55 +0900
From: uemuraアットマークvirus.kyoto-u.ac.jp
Subject: [Jfly] bGal staining
岡部さんへ
>抗体はJakson's Lab.の抗rabbit IgG-HRP conj.を1:500-1:1000で用いています。
使われている二次抗体は、カタログ番号でいうとどれですか？ こちらは生化学
工業を通して、Jackson lab の抗体を購入しています。正式名称も合わせて
教えて頂けませんか？
上村匡
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Date: Mon, 10 Jul 1995 17:36:53 +0900
From: okabeアットマークigaku.md.tsukuba.ac.jp (岡部正隆)
Subject: [Jfly] bGal staining
>>抗体はJakson's Lab.の抗rabbit IgG-HRP conj.を1:500-1:1000で用いています。
>
>使われている二次抗体は、カタログ番号でいうとどれですか？ こちらは生化学
>工業を通して、Jackson lab の抗体を購入しています。正式名称も合わせて
>教えて頂けませんか？
>
>上村匡
何も書きませんで失礼いたしました。使用している２次抗体は、、、
Jackson ImmunoReseach Laboratories, Inc.
Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)
Code-Number: 111-035-003
生化学工業のカタログでは IgG/rabbit のところに出ています。
コードは286765です。
rabbitのPAbとmouseのMAbを用いたdouble stainigでも特に問題はなかったと思いま
す。double staining用に新しい抗体を最近購入しましたが、まだ使用していません。
参考までに書いておきますと、、、
Jackson ImmunoReseach Laboratories, Inc.
Peroxidase-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (minimal
cross-reaction to Bovine, Chicken, Goat, Guinea Pig, Hamster, Horse, Human,
Mouse, Rat, and Sheep Serum Proteins)
Code-Number: 711-035-152
生化学工業のカタログでは IgG (minxBov,Gt,Hrs,Hu,Ms,Rat,Shp Sr Prot)/rabbit
のところに出ています。
コードは286755です。
岡部正隆
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Date: Thu, 11 Apr 1996 09:33:53 +0900
From: akomatsuアットマークresearch.twmc.ac.jp
Subject: [Jfly] antibody b-gal stain
辻村：
>エンハンサートラップラインのハエの胚でのｂ−ｇａｌの
>発現パターンを抗体で調べたいのですが、適当な抗体と
>染[法を御存知の方はご連絡頂ければ幸いです。
> 抗体 メーカー、製品名等
> 染色法 固定から抗体染色、２次抗体、発色法の
> プロトコール
>その他これに関する情報はどんなものでも感謝します。
methods について書いた一般的な本として、次のもの有用な情報が載っております。
L.S.B. Goldstein & E.A. Fyrberg (eds.):
Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.
Methods in Cell Biology, Vol. 44,
Academic Press, 1994, pp755.
小松 明
東京女子医科大学 第一生理学教室