 | Jfly ディスカッション |
Discussion Menu | Jfly Japanese Home Page | Jfly English Home Page
P-lacW ベクターの構造と P 配列の部分の外し方
Date: Mon, 9 Oct 1995 11:22:55 +0900
From: i45571aアットマークnucc.cc.nagoya-u.ac.jp (shin sugiyama)
> 山口大の村上です
>P-lacWを飛ばしてミュータントを作り、さらにプラスミドレスキューもうまくいきま
>した。そこでP因子の下流側のウイングをふくむゲノム断片をプローブにしてcDNAラ
>イブラリーをスクリーニングしたところP因子そのものが釣れてしまいました。下流
>側のウイングを除去してプローブにすればよいのではと思いますが、ウイングを除去
>する簡単な方法（または、適当な制限酵素）をご存じでしたら教えて下さい。またP-
>lacW のシークエンスを知りたいのですが、どうすればよいのでしょうか？
>ENTREZ で試してみたのですが、うまく引けませんでした。よろしくおねがいします
名大の杉山伸です
「雑用などに忙殺されている」という上村匡さんに代わりに答えるよう頼ま
れました。以前上村さんに送っていただいたP-lacWの作製過程を示したMAPをfaxで送
ります。ぼくの知る限りP-lacWの全シークエンスはデータベースには入ってないので
MAPに基づいて必要な部分のシークエンスを文献かデータベースから調べるしかない
と思います。但し、P-lacWの3-prime BamHI site から P element end までのシーク
エンスは伊藤啓さんが Jfly にいれてくれましたので見てください（gopher://202.2
41.18.171/picture/schema/PlacW_map.pict)。ここに村上さんが期待しているように
P element の wing をきれいに切り取る制限部位があるかどうかはぼくは調べていま
せん（端から0.24kbのところにHindIIIはあるけど）。そこで原則的にはplasmid res
cueしたgenomic fragmentの中から切断部位をさがした方がいいと思います。また、p
lasmid rescueしたgenomic fragmentがintronやregulatory sequenceしか含まない可
能性も高いので、そのような場合はcDNA library の screening はできません。一度
genomic fragmentをprobeにwhole mount in situ を行って、lac-Z の発現と一致す
るかどうか、transcribed sequence があるかどうか確認した方がいいと思います。
また、それによってどのstageのcDNA libraryをscreenしたらいいかも判断できます
。発現が検出できない場合はぼくだったらさきにphageのgenomic libraryをscreenし
ます。またplasmid rescueしたgenomic fragmentが短すぎて切り出すのに使える制限
部位がない場合もそうすると思います。もちろんP-lacWの逆側（5-prime）をplasmid
rescue することもできます。詳しいことがわからないので余計な心配かもしれませ
んが思い着くこと書かせていただきました。
杉山伸
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
Date: Mon, 9 Oct 1995 13:10:03 +0900
From: shayashiアットマークlab.nig.ac.jp (Shigeo Hayshai)
村上様
Ｐの配列をはずす最も単純な方法はＰの端の配列を使ってrescueしたプラスミドをte
mplateにしてPCRをすることです。Ｐの両端は31baseの繰り返し配列があるのでこれ
にhybridizeして外側に向かうプライマーとresucueの際に使ったサイトの近傍にアニ
ールするプライマーを作製すれば増幅できるはずです。制限マップを作る手間とあま
り使わないような制限酵素を購入するコストを考えればプライマー外注することも割
が合うかもしれません。
林 茂生