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in cilico cloning のやり方？
From: Yasumitsu_Takagi/college.COLLEGEアットマークcollege.fdcnet.ac.jp
Date: 30 Mar 99 13:08:54
Subject: [Jfly] in cilico cloning
J-FLYの皆様、こんにちは。
最近流行の in cilico cloning というのをやってみたいのですが、情けないこと
にやりかたがよくわかりません。ESTのようなcDNA data にアクセスするのは理解
できるのですが、genome data を直接利用するのはどうしたら良いのでしょうか？
つまり、
（１）塩基配列を送って、DBのコンピューターでゲノム配列をスプライシングし
てもらうのか、それとも予想スプライシングに基づくDBがすでに存在するのか？
（２）あるいはアミノ酸配列を送って、DBの方でゲノム配列をスプライシング→
翻訳までしてもらったほうが精度が高いのか？
（３）さらに、生物ごとに異なるスプライシングの法則を考慮したやり方がある
のか？
以上の疑問につきまして、どなたかお答えいただければ幸いです。
どうぞ宜しくお願いします。
高木康光
福岡歯科大学・助教授
学術フロンティア研究センター
（〒８１４ー０１９３）
福岡市早良区田村２ー１５ー１
電話；０９２ー８０１ー０４１１（内線２３０）
ファックス；０９２ー８０１ー０６８５
電子メール；ytakaアットマークcollege.fdcnet.ac.jp
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From: Hirotaka Kanuka
Date: Tue, 30 Mar 1999 14:05:16 +0900
Subject: [Jfly] in cilico cloning
嘉糠＠阪大神経解剖と申します。あまり参考にはなりませんが・・・。
>最近流行の in cilico cloning というのをやってみたいのですが
スプライシングを含めてここで問題の中心になるのは、「果たしてこの程度の相同性でライブラリーをスクリーニングする価値があるのか？」ということではないでしょうか。万人の悩みかと思います。僕もよく悩みます。
>（１）塩基配列を送って、DBのコンピューターでゲノム配列をスプライシングし
>てもらうのか、それとも予想スプライシングに基づくDBがすでに存在するのか？
>（２）あるいはアミノ酸配列を送って、DBの方でゲノム配列をスプライシング→
>翻訳までしてもらったほうが精度が高いのか？
>（３）さらに、生物ごとに異なるスプライシングの法則を考慮したやり方がある
>のか？
私の知る限り、現在availableなデータベース検索プログラムでスプライシングを考慮した(1)及び(2)が出来るものは無いのではないでしょうか。あくまでゲノムでもThree frame順繰りにアミノ酸に翻訳し（stop codonを含もうが構わず）、その上で相同性検索を行っていると思います。(3)もかなり厳しいと思います。
では自分の探しているタンパク質の相同分子をTBLASTN等で検索した際、P1 cloneなどのゲノムの部分予想アミノ酸配列がヒットした場合はどうするのか？http://www-mbi3.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~kihara/biolink/genefind.html等にスプライシングサイト検索ツールがありますが、正確なスプライシングを予想することは、僕の勉強不足もたたって正直な話”無限である”印象を受けます。自分の経験として、P1 cloneの部分配列を手に入れた時はスプライシングの予想は断念し、そこから5'側及び3'側のexonと思われそうなゲノム配列のprimerを幾つか合成しRT-PCRを行い、運良く(?)増幅されたcDNA断片をprobeとしてライブラリーをスクリーニングしました。この運良く増えたcDNAをまずはシーケンスするのがpredicted proteinの情報をより多くかつ素早く得る現実的な手段かと思います。
しかし世の中にはゲノムから寸分違わず翻訳されるアミノ酸をfull lengthで予想する、いわゆる”ドメインハンター”と呼ばれる人種がいます。ある著名なドメインハンターから直接お話を伺ったことがあるのですが、”exonを繋ぐ時に重要視することは、一番に高次構造。出来上がるタンパク質は必ず立体的な安定性を確保するはずので、構造上ムリがないように計算しつつ予測する”だそうです。あ、こりゃ自分にはムリだわ、と思いました（苦笑）。
ですがもっとゲノムデータベースを活用して、なるべく手間を省く良い方法があるかも知れません。他の方からもご教唆頂けたら幸いです。
嘉糠洋陸
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嘉糠洋陸 [Hirotaka Kanuka]
kanukaアットマークnana.med.osaka-u.ac.jp
http://www.geocities.co.jp/Technopolis/5510/index.html
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大阪大学医学部バイオメディカル教育研究センター神経機能解剖学
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