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後期胚のリアルタイム観察
Date: Tue, 03 Oct 2000 23:33:38 +0900
Subject: [Jfly] 後期胚のリアルタイム観察についての質問。
From: Tadao USUI
JFLYの皆様、こんにちは。
京大ウイルス研の碓井理夫と申します。ライブで観察する上でのジレンマについて、
皆様に質問させて下さい。
孵化直前の胚で一部のニューロンをGFP標識し、軸索や樹状突起が伸長する過程をリ
アルタイムで観察しようと現在試みています。しかし、サンプルを室温で良好な状態
に保つと、当然のことながら盛んに蠕動運動してしまい、系時的な観察ができません。
温度を低くして運動性を下げるという手もありますが、そうすると今度は正常に発生
しなくなってしまいます。
このような場合、たとえば筋肉だけを麻痺させるような適当な薬剤（筋弛緩剤？）を
使えばいいと考えたりするのですが、そのようなことは可能でしょうか。薬剤に限ら
ず、なんらかの対処法をご存じの方あるいは同様のご経験をされた方がおられました
ら、ご教唆願えれば幸いです。
_/_/_/_/_/_/ 碓井理夫 tusuiアットマークvirus.kyoto-u.ac.jp
_/_/_/_/_/_/ 京都大学ウイルス研究所
_/_/_/_/_/_/ 遺伝子動態調節研究部門
_/_/_/_/_/_/ 分子遺伝学分野（上村研）
_/_/_/_/_/_/ phone: 075-751-3976 / fax: 075-751-3989
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Date: Wed, 4 Oct 2000 10:05:35 +0900
From: Akinao Nose
Subject: [Jfly] 後期胚のリアルタイム観察についての質問。
能瀬＠東大です。
私たちも同様の問題を経験しています。対処法があったら是非知りたいです。
現MITの吉原さんが電気生理の実験の際、胚が動くのを避けるのに筋蛋白質のミュー
タントを利用されていたと思うのですが、これを応用することは可能でしょうか。吉
原さんコメントあったら教えてください。
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From: "Shigeo Hayashi"
Subject: [Jfly] RE: [Jfly] 後期胚のリアルタイム観察についての質問。
Date: Wed, 4 Oct 2000 11:24:02 +0900
薬剤名は忘れました（Sodium AzideかLevamisolではない）が遺伝研の石原さんに
お借りした麻酔剤はハエの幼虫には効きませんでした。
林
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Date: Wed, 04 Oct 2000 10:53:22 +0800
Subject: [Jfly] 後期胚のリアルタイム観察についての質問。
From: Tadashi Uemura
上村＠京都大です。
以前、線虫を研究しておられる東京大の杉本さんに、同じ趣旨の質問をし、以下の返
事を頂きました。
「線虫の胚は卵殻があるため、ほとんどの場合レーザー等で穴を開けない限り薬剤は
通過しません。（胚発生過程の動きを止めるためには筋肉関係のmutantとのdoubleに
することは可能です。）孵化後の麻酔剤としては通常はSodium AzideかLevamisolが
使われるのですが、GFPがquenchされるので、最近はIvermectinやBDMが使われている
ようです（私はまだ使ったことがありません）。長くなりますが、Worm Breeders
Gazetteの記事を最後に添付しておきます。（後略）」
挙げられていた薬剤を試そうとしていましたが、遺伝研の林さんに「あれは効かんか
た。」と告げられ、がくっときて自分では試していません。そうでしたよね、林さん。
上村 匡
〒６０６－８５０７
京都市左京区聖護院川原町５３
京都大学ウイルス研究所
遺伝子動態調節研究部門
分子遺伝学研究分野
（電話） 075-751-4031
（ファックス）075-751-3989
（メール）tuemuraアットマークvirus.kyoto-u.ac.jp
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Date: Wed, 04 Oct 2000 11:46:41 +0800
Subject: [Jfly] 後期胚のリアルタイム観察についての質問
From: Tadashi Uemura
on 00.10.4 10:24 AM, Shigeo Hayashi at shayashiアットマークlab.nig.ac.jp wrote:
>
>> 上村＠京都大です。
>
>> 挙げられていた薬剤を試そうとしていましたが、遺伝研の林さんに「あれは効かん
>> か
>> た。」と告げられ、がくっときて自分では試していません。そうでしたよね、林さ
>> ん。
> 薬剤名は忘れました（Sodium AzideかLevamisolではない）が遺伝研の石原さんに
> お借りした麻酔剤はハエの幼虫には効きませんでした。
>
> 林
>
失礼しました。上村
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Worm Breeder's Gazette 15(2): 16 (February 1, 1998)
Ivermectin as a Paralytic Agent
Joe Dent, Leon Avery
UT Southwestern Medical Center at Dallas, 6000 Harry Hines Blvd., Dallas, TX
75235-9148
We have found it difficult to paralyze worms for the purpose of
visualizing and/or photographing GFP expression. The best agent for
paralyzing worms, sodium azide, quenches GFP fluorescence. We have tried
1-phenoxy-2-propanol, ethanol and levamisol and have found that
effective doses of these drugs significantly distort the worm's
morphology. Ivermectin is currently our paralytic of choice. Worms
soaked in M9 with 1% DMSO and 100 ng/ml ivermectin for a couple hours
are generally inert without significant morphological distortion apart
from the occasional vacuole. The worms can also be treated by placing
them on ivermectin plates (containing 1% DMSO and 100ng/ml ivermectin)
which takes longer but allows you to look at them to see when they
become paralyzed. Eggs of paralyzed worms can always be recovered and
sometimes adults, when not too far gone, can recover from ivermectin.
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Worm Breeder's Gazette 15(3): 9 (June 1, 1998)
Paralysis of worms by 2,3-butanedione monoxime (BDM)
Miriam B. Goodman, Marty Chalfie
1012 Fairchild Center, Columbia University, New York, NY 10027
As noted by Dent & Avery (WBG 15(2):16), drugs used to paralyze worms
either quench GFP fluorescence (Na azide) or create unwanted distortions
in morphology (levamisol, 1-phenoxy-2-propanol, ethanol). At the
suggestion of Micah Siegal (California Institute of Technology), we
tested whether 2,3-butanedione monoxime (BDM, Aldrich Cat #11, 213-5), a
drug that interferes with stimulus-contraction coupling in vertebrate
muscle , could paralyze intact worms. We find that BDM is effective for
paralyzing worms and inhibiting pharyngeal muscle contractions. Both
GFP fluoresence and worm morphology (apart from the occasional vacuole)
are preserved during BDM treatment. Upon exposure to a buffered
solution of BDM (0. 3M BDM, 10 mM NaHEPES, pH 7.2), worms begin to
twitch and eventually become paralyzed. Worms readily recover from
brief (< 20 min) exposures and eggs from treated adults appear to hatch
and develop normally. The effect of BDM is concentration-dependent: 83
+/- 8% (mean +/- s.d., n = 360) and 39 +/- 2% (n = 345) of worms are
paralyzed after 10 min in a buffered solution of 0.3 and 0.1 M BDM,
respectively. While high concentrations of BDM are needed to paralyze
intact worms within a reasonable amount of time, the effect cannot be
purely osmotic since soaking worms in physiological saline of comparable
osmolarity (323 mOsm) does not result in paralysis. Since BDM is
effective at millimolar concentrations in vertebrate muscle, we believe
that high concentrations are needed to paralyze intact worms because of
the barrier presented by the cuticle.
Our current procedure for using BDM is: (1) wet a small filter disk
(0.25" diameter, punched out of Whatman No. 2 filter paper with a hole
punch) with 6 microliters of 0.3 M buffered BDM, (2) to transfer worms
in ~4 microliters of M9 to the surface of the filter disk, (3) incubate
for 10 min at room temperature, (4) invert the filter disk on the
surface a 2% agarose pad (in water), remove filter and gently apply a
coverslip. Worms can also be paralyzed by transferring them to the
surface of a BDM-agarose pad. A second layer of agarose can be used in
place of the coverslip and may reduce the possibility of crushing worms.
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From: "motojiro Yoshihara"
Subject: [Jfly] CyOzAUbxz貰麑`嚥
Date: Thu, 15 Jun 2000 13:56:44 EDT
From Moto Yoshihara in MIT (I am writing in English because some people
could not read my last Japanese mail by terrible "Mojibake");
>実験の目的は、Gal4エンハンサートラップのlethal系統について、mutant
>homoのembryoで気管または成虫原基に形態異常を示す系統をスクリーニングすること
>です。
Taniguchi-san,
I remember that air was not contained in tracheae in most of my CyO
homozygotes even in the later embryonic stages. So, please be careful if
you are looking tracheal phenotype since there might be some defect in
tracheal morphology in them. Good luck! Moto
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From: "motojiro Yoshihara"
Subject: [Jfly] 笞笂盟^C論病�ﾂ命眤
Date: Thu, 05 Oct 2000 13:33:26 EDT
>From: Akinao Nose
>Reply-To: jflyアットマークnibb.ac.jp
>To: jflyアットマークnibb.ac.jp
>Subject: [Jfly] 後期胚のリアルタイム観察についての質問。
>Date: Wed, 4 Oct 2000 10:05:35 +0900
>
>能瀬＠東大です。
>
>私たちも同様の問題を経験しています。対処法があったら是非知りたいです。
>
>現MITの吉原さんが電気生理の実験の際、胚が動くのを避けるのに筋蛋白質のミュー
>タントを利用されていたと思うのですが、これを応用することは可能でしょうか。吉
>原さんコメントあったら教えてください。
>
This is Moto Yoshihara at MIT,
Sorry for my delayed response even if I got "goshimei".
Nose-san and others, you can use Myosin heavy chain mutant (Mhc[1]) for the
purpose. The mutant is useful because it is muscle specific. I have made
it certain by myself that it is not expressed (or expressed at very low
level) in motor neurons. The terminals (and muscles, of course) in the
mutant look somewhat "Nanjyaku", but properties of synapses in the mutant
are almost normal. Our paper using it will appear soon in Journal of
Neuroscience, and you can see detail in it.
Actually, this mutant has been isolated by Dr. Mogami (I am very grateful to
him) very close to you. So, you can get it from him immediately. I hope it
helps you. Cheers, Moto
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Motojiro Yoshihara, Ph.D.
Center for Learning and Memory
Massachusetts Institute of Technology
50 Ames St. Room E18-605
Cambridge, MA 02139
TEL 1-617-452-2726
FAX 1-617-452-2249
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Date: Tue, 10 Oct 2000 12:34:14 +0900
Subject: [Jfly] 後期胚のリアルタイム観察についての質問。
From: Tadao USUI
碓井＠京大です。
皆様、貴重なアドバイス有り難うございました。
さっそく、Mhcミュータントを利用してみます。
_/_/_/_/_/_/ 碓井理夫 tusuiアットマークvirus.kyoto-u.ac.jp
_/_/_/_/_/_/ 京都大学ウイルス研究所
_/_/_/_/_/_/ 遺伝子動態調節研究部門
_/_/_/_/_/_/ 分子遺伝学分野（上村研）
_/_/_/_/_/_/ phone: 075-751-3976 / fax: 075-751-3989