卵の抗体染色用／in situ 染色に適当な固定法/TITLE> </HEAD>  <link href="../../../jfly2.css" rel="stylesheet" type="text/css"> <link href="../../../fontstyle.css" rel="stylesheet" type="text/css"> <link href="../../../base.css" rel="stylesheet" type="text/css"> <meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis"><style type="text/css">  </style></HEAD> <BODY BGCOLOR="#FFFFFF"> <TABLE width="600"> <TR><TD><img src="../../../image/title.gif" width="339" height="29"></TD><TD><H3>Jfly ディスカッション</H3></TD></TR> </TABLE> <img src="../../../image/bar2.gif" width="600" height="13"><br> <B><A HREF="/html/discussion/index.html">Discussion Menu</A> | <A HREF="/index_j.html">Jfly Japanese Home Page</A> | <A HREF="/index.html">Jfly English Home Page</A></B>  <H3>卵の抗体染色用／in situ 染色に適当な固定法</H3> <BR> From: "Yukio Nakamura" <j8397058アットマークed.noda.sut.ac.jp><BR> Subject: [Jfly] ovaryの染色<BR> Date: Tue, 13 Mar 2001 11:20:16 +0900<BR> <BR> 東京理科大学の中村と申します。<BR> 現在、ショウジョウバエ卵の研究をしているのですが、<BR> このショウジョウバエ卵を抗体染色する方法について、<BR> お聞きしたいことがあります。<BR> 抗体染色の方法を知るために、科学論文をいくつか見た所、<BR> 固定方法などが一定でありませんでした。<BR> どのような方法が適切であるか、宜しかったら教えて頂けないでしょうか?<BR> <BR> また、ショウジョウバエ卵のin situ ハイブリダイゼーション法で、<BR> 検出するシグナルを強くし、バックグラウンドを減らす方法がありましたら、<BR> そちらの方も宜しくお願い致します。<BR> 私の場合、NBT/BCIPでの反応後、エタノール系列で脱水し、<BR> 最後に、キシレンに浸しています。これにより、シグナルは強くなったように<BR> 観察されるのですが、バックグラウンドも出ているようなのです。また、この後、<BR> 50%パラマウントでマウントをしているのですが、他に良いものはあるのでしょうか?<BR> <BR> 中村征史<BR> <BR> 東京理科大学生物工学科松野研究室<BR> TEL: 81-471-24-1501 (ext.4401)<BR> FAX: 81-471-25-1841<BR> E-mail: j8397058アットマークed.noda.sut.ac.jp<BR> <BR> <BR> ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊<BR> <BR> Date: Tue, 13 Mar 2001 08:52:56 +0000<BR> Subject: [Jfly] ovaryの染色<BR> From: Fumihiko Hamada <hamadaアットマークmrc-lmb.cam.ac.uk><BR> <BR> > このショウジョウバエ卵を抗体染色する方法について、<BR> > お聞きしたいことがあります。<BR> > 抗体染色の方法を知るために、科学論文をいくつか見た所、<BR> > 固定方法などが一定でありませんでした。<BR> > どのような方法が適切であるか、宜しかったら教えて頂けないでしょうか?<BR> <BR> 4% paraformaldehyde 0.1% Tween20 PBS 20 min RT<BR> あるいは<BR> 3.7% formaldehyde 0.1% Tween20 PBS 20 min RT<BR> <BR> 私の場合、どちらの方法でも問題なく ovary (egg chamber) が染まりました。<BR> <BR> はまだふみひこ<BR> <BR> ************************************<BR> Fumihiko Hamada<BR> MRC Laboratory of Molecular Biology<BR> Hills Road<BR> Cambridge, CB2 2QH<BR> United Kingdom<BR> Phone +44 (1223) 402 026<BR> FAX +44 (1223) 412 142<BR> E-mail hamadaアットマークmrc-lmb.cam.ac.uk<BR> ************************************<BR> <BR> <BR> ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊<BR> <BR> Date: Tue, 13 Mar 2001 18:41:41 +0900<BR> Subject: [Jfly] ovaryの染色<BR> From: Naoto JUNI <njuniアットマークmn.waseda.ac.jp><BR> <BR> on 3/13/01 11:20 AM, Yukio Nakamura at j8397058アットマークed.noda.sut.ac.jp wrote:<BR> <BR> > また、ショウジョウバエ卵のin situ ハイブリダイゼーション法で、<BR> > 検出するシグナルを強くし、バックグラウンドを減らす方法がありましたら、<BR> > そちらの方も宜しくお願い致します。<BR> > 私の場合、NBT/BCIPでの反応後、エタノール系列で脱水し、<BR> > 最後に、キシレンに浸しています。これにより、シグナルは強くなったように<BR> > 観察されるのですが、バックグラウンドも出ているようなのです。また、この後、<BR> > 50%パラマウントでマウントをしているのですが、他に良いものはあるのでしょうか?<BR> <BR> 一般的に言って、NBT/BCIPから生じる有色沈殿は有機溶媒に溶けるので、キシレンや<BR> 有機溶媒系のマウント剤は禁物なのでは？　マウント直後はいいかもしれませんが、<BR> すぐにでも、にじみや退色を起こすおそれがあります。無難なところでは、グリセロー<BR> ルシリーズでアップしてグリセロールマウント（80 % glycerol) でしょうか。ノマ<BR> ルスキーで観察するときなど、キシレンで透徹すると屈折率が低すぎてかえって見づ<BR> らいことがありますが、グリセロールなら程良い屈折率が得られるというのも、よい<BR> 点だと思います。<BR> <BR> ご質問の主旨に関して、本質的なアドバイスは、その道のエキスパートの方々にお任<BR> せしましょう。<BR> ************************************************************************<BR> 従二　直人　じゅうに　なおと<BR> 早稲田大学　人間科学部　人間基礎科学科　遺伝学教室（山元研究室　東伏見）<BR> 〒202-0021　東京都　西東京市　東伏見2-7-5<BR> Phone: 0424-50-5824 Fax: 0424-50-5825<BR> e-mail: njuniアットマークmn.waseda.ac.jp<BR> ************************************************************************ <BR> <BR> <BR> ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊<BR> <BR> From: Kayoko　Sakurai <kayoアットマークcomp.metro-u.ac.jp><BR> Subject: [Jfly] [Jfly] RE: ovaryの染色<BR> Date: Tue, 13 Mar 2001 19:46:22 +0900<BR> <BR> はじめまして。都立大の桜井というものです。<BR> <BR> ロシュが配布している「in situ ハイブリダイゼーション応用マニュアル」に、<BR> ポリビニルアルコールを利用したBCIP-NBT反応のシグナル増強法が載っています。<BR> マニュアルでは植物の組織切片に対して行っていますが、そのままハエの成虫原基に<BR> 応用可能でした。<BR> 有機溶媒で脱水する方法よりクリアなシグナルが得られます。<BR> お薦めの方法ですがovaryでは試していません。<BR> 原理としては、高分子（40～100kDa）ポリビニルアルコール（PVA）をBCIP-NBT反応<BR> に加えることにより<BR> Medium中に拡散しやすい中間体（formazan）の拡散を防ぎ<BR> バックグラウンドの増加なしにシグナルを増強することが出来る、というものです。<BR> 以下、概要を記載します：<BR> <BR> １. Tris-NaCl-PVA stock solutionを作成する。100mM NaClを含む100mM<BR> Tris-HCl(pH9.5)を９０℃に熱し、<BR> PVA（40kDaまたは70～100kDa、Sigma）を溶解して終濃度１０％（w/v）とする。<BR> 室温で保存。<BR> 2. Tris-NaCl-PVA stock solution 1mlに、1M MgCl2 500ml、NBT 4.5ml、BCIP 3.5ml<BR> を加え、最終発色液とする。<BR> （この時点で粘性はかなり高いです）<BR> 3. サンプルを発色系のstaining bufferに置き換えた後、最終発色液にサンプルを入<BR> れ、暗所で発色させる。<BR> <BR> Reference: DeBlock,M;Debrouwer,D. (1993) RNA-RNA in situ hybridization using<BR> digoxigenin-labeled probes: the use of high molecular weight polyvinyl<BR> alcohol in the alkaline phosphatase indoxyl-nitroblue tetrazolium reaction.<BR> Anal.Biochem.215,86-89.<BR> <BR> *******************************************************<BR> 桜井　香代子<BR> <BR> 東京都立大学大学院　理学研究科　生物科学専攻　生化学研究室<BR> Tel: 0426-77-2570<BR> Fax: 0426-77-2559<BR> E-mail: kayoアットマークcomp.metro-u.ac.jp<BR> *******************************************************<BR> <BR> <BR> ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊<BR> <BR> From: Kayoko　Sakurai <kayoアットマークcomp.metro-u.ac.jp><BR> Subject: [Jfly] 訂正： RE: ovaryの染色<BR> Date: Wed, 14 Mar 2001 10:02:42 +0900<BR> <BR> <BR> 都立大学の桜井です。<BR> 先ほどお送りしたメールに誤りがありました。<BR> stock solutionにMaCl2とNBT,BCIPを加える段階で、<BR> 正しくは1M MgCl2 50μl （終濃度 50mM）、NBT 4.5μl、BCIP 3.5μl　です。<BR> <BR> <BR> ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝数ヶ月後＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝<BR> <BR> <BR> <BR> From: "Yukio Nakamura" <j8397058アットマークed.noda.sut.ac.jp><BR> Subject: [Jfly] ovaryの抗体染色<BR> Date: Tue, 8 May 2001 15:09:23 +0900<BR> <BR> 東京理科大学の中村と申します。<BR> 以前、ovaryの抗体染色についてお聞きし、染色を続けてきたのですが、<BR> うまく染色がされません。<BR> 例えば、抗体が浸透していないせいか、周りのコリオンだけが染まってしまったり、<BR> あるいは、染色が全く起こらず、egg chamberは半透明のままであったりです。<BR> 私が染色を行なっている抗体は、SIGMA, No.M8159の<BR> monoclonal anti-MAP kinase, activated(di-phosphorylated ERK-1&2)(mouse IgG<BR> isotype)です。<BR> <BR> 私のプロトコールは、以下の通りです。<BR> １、2日間yeastを食べさせたメス5匹をPBTw(PBS+0.1％Tween20)内で、解剖し、ovay<BR> を取り出す。<BR> ２、そのまま4％formaldehyde(ME free)/PBTwで20min固定。<BR> ３、PBTwで3回wash。<BR> ４、PBTw中で、ovaryからovarioleに、そして各egg chamberごとに、分ける。<BR> ここで、1.5mlエッペンチューブに移します。<BR> ５、ME, 3×5min洗浄。<BR> ６、ME中で-20℃、一晩。<BR> ７、PBTw, 3×10min洗浄。<BR> ８、5%NGS/PBTw, 40min。<BR> ９、anti-dpERK抗体(1/200希釈)/PBTw, RT, 2hr。<BR> 10、PBTw, 3×10min洗浄。<BR> ここからは、DAB染色を行なっています。<BR> 11、ビオチン標識抗マウスIgG, 1hr。<BR> 12、PBTw, 3×10min洗浄。<BR> 13、アビジンDH/ビオチン化ペルオキシダーゼ, 40min。<BR> 14、PBTw, 3×5min洗浄。<BR> 15、0.5mg/ml DAB/PBTw, 10min。<BR> 16、終濃度0.03%になるように、hydroxy peroxidを加える。<BR> 発色反応開始<BR> 17、0.02%アジ化ナトリウム/PBTwで洗浄・反応停止。<BR> <BR> 基本的には、以上のプロトコールで染色を行なっておりますが、<BR> 多くの論文では、このanti-dpERK抗体を4℃で一晩、反応させていましたので、<BR> それに習いそのようにすると、全く抗体が浸透していないような状態であります。<BR> また、発色反応においては、どんなに長くしても、<BR> 特異的なシグナルもバックグラウンドも出てこない状況です。<BR> どのような改善をしたら、egg chamberでの抗体染色によるシグナルを得られる事が<BR> できますか?<BR> どなたか良いアドバイスを待っております。<BR> 宜しかったら、egg chamberの抗体染色のプロトコールを教えてもらいたいのです<BR> が。<BR> お願い致します。<BR> <BR> 中村征史<BR> <BR> 東京理科大学基礎工学研究科生物工学専攻<BR> 松野研究室<BR> <BR> <BR> Yukio Nakamura<BR> Science University of Tokyo<BR> Department of Biological Science and Technology<BR> Yamazaki, Noda, Chiba 278-8510, Japan<BR> TEL: 81-471-24-1501 (ext.4401)<BR> FAX: 81-471-25-1841<BR> E-mail: j8301628アットマークed.noda.sut.ac.jp<BR> <BR> <BR> ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊<BR> <BR> Date: Tue, 8 May 2001 16:40:27 +0900<BR> From: Tomokazu Ohshiro <tohshiroアットマークidac.tohoku.ac.jp><BR> Subject: [Jfly] ovaryの抗体染色<BR> <BR> At 3:09 PM +0900 01.5.8, Yukio Nakamura wrote:<BR> >東京理科大学の中村と申します。<BR> >以前、ovaryの抗体染色についてお聞きし、染色を続けてきたのですが、<BR> >うまく染色がされません。<BR> >例えば、抗体が浸透していないせいか、周りのコリオンだけが染まってしまったり、<BR> >あるいは、染色が全く起こらず、egg chamberは半透明のままであったりです。<BR> >私が染色を行なっている抗体は、SIGMA, No.M8159の<BR> >monoclonal anti-MAP kinase, activated(di-phosphorylated ERK-1&2)(mouse IgG<BR> >isotype)です。<BR> ><BR> >私のプロトコールは、以下の通りです。<BR> >１、2日間yeastを食べさせたメス5匹をPBTw(PBS+0.1％Tween20)内で、解剖し、ovay<BR> >を取り出す。<BR> >２、そのまま4％formaldehyde(ME free)/PBTwで20min固定。<BR> >３、PBTwで3回wash。<BR> >４、PBTw中で、ovaryからovarioleに、そして各egg chamberごとに、分ける。<BR> >ここで、1.5mlエッペンチューブに移します。<BR> >５、ME, 3×5min洗浄。<BR> >６、ME中で-20℃、一晩。<BR> >７、PBTw, 3×10min洗浄。<BR> >８、5%NGS/PBTw, 40min。<BR> >９、anti-dpERK抗体(1/200希釈)/PBTw, RT, 2hr。<BR> >10、PBTw, 3×10min洗浄。<BR> >ここからは、DAB染色を行なっています。<BR> >11、ビオチン標識抗マウスIgG, 1hr。<BR> >12、PBTw, 3×10min洗浄。<BR> >13、アビジンDH/ビオチン化ペルオキシダーゼ, 40min。<BR> >14、PBTw, 3×5min洗浄。<BR> >15、0.5mg/ml DAB/PBTw, 10min。<BR> >16、終濃度0.03%になるように、hydroxy peroxidを加える。<BR> >発色反応開始<BR> >17、0.02%アジ化ナトリウム/PBTwで洗浄・反応停止。<BR> <BR> <BR> まさかとは思いますが、ステップ１０以降ステップ１６までに0.02%アジ化ナトリウ<BR> ム/PBTwは使っていませんか？<BR> おはずかしいお話ですが私は以前、アジ化ナトリウムがペルオキシダーゼを強力に阻<BR> 害することを知らずに、たまたまそばにあったアジ化ナトリウム/PBTwを発色前に<BR> wash で使ったことがあって、その時は見事にバックグランドすら染まりませんでし<BR> た。<BR> <BR> ポイントがずれていたらすいません。<BR> <BR> 大城　朝一<BR> <BR> 東北大学　加齢医学研究所<BR> <BR> <BR> ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊<BR> <BR> From: "Yukio Nakamura" <j8397058アットマークed.noda.sut.ac.jp><BR> Subject: [Jfly] RE: [Jfly] ovaryの抗体染色<BR> Date: Tue, 8 May 2001 17:26:50 +0900<BR> <BR> >まさかとは思いますが、ステップ１０以降ステップ１６までに0.02%アジ化ナトリウ<BR> >ム/PBTwは使っていませんか？<BR> >おはずかしいお話ですが私は以前、アジ化ナトリウムがペルオキシダーゼを強力に<BR> 阻<BR> >害することを知らずに、たまたまそばにあったアジ化ナトリウム/PBTwを発色前に<BR> >wash で使ったことがあって、その時は見事にバックグランドすら染まりませんでし<BR> >た。<BR> <BR> 大城さん、ありがとうございます。<BR> 私がアジ化ナトリウムを加えるのは、最終的に発色反応を停止する時のみです。<BR> ですから、その問題は回避できていると考えられます。<BR> どんなささいな注意点でもありましたら、また宜しくお願いします。<BR> <BR> 中村征史<BR> <BR> 東京理科大学基礎工学研究科生物工学専攻<BR> 松野研究室<BR> <BR> Yukio Nakamura<BR> Science University of Tokyo<BR> Department of Biological Science and Technology<BR> Yamazaki, Noda, Chiba 278-8510, Japan<BR> TEL: 81-471-24-1501 (ext.4401)<BR> FAX: 81-471-25-1841<BR> E-mail: j8301628アットマークed.noda.sut.ac.jp<BR> <BR> <BR> ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊<BR> <BR> Date: Wed, 9 May 2001 14:29:43 -0700<BR> From: Makoto Sato <makotosアットマークitsa.ucsf.edu><BR> Subject: [Jfly] Re: ovaryの抗体染色<BR> <BR> 佐藤＠UCSFです。<BR> <BR> まずanti-dpMAPKですが、私の印象ではこの抗体は固定が強い方がよく染まるようです。<BR> discを染色しているのですが、いつも8%paraformaldehyde/PBS<BR> で30分固定しています。抗体濃度は2000倍です。<BR> 良く染まることは染まるのですが、同時に染めたdiscどうし、もしくは一つのdiscの <BR> 中でも<BR> シグナルの強さにばらつきがあることが多いです。何故かはわかりませんが、元々の<BR> shiloのscienceのペーパーにもdiscでは結果が安定しないようなことが書いてあった <BR> と思います。<BR> というわけでovaryではどうかわかりませんが、anti-dpMAPKを使っているからという<BR> 可能性も考えられます。他の抗体も試してみてはいかがでしょうか？？<BR> <BR> ovaryの染色のプロトコールについてですが、私がやったときはdiscと同じで、<BR> PBS中でdissect<BR> 4%Paraformaldehyde/PBSで20min 固定（ovarioleまでほぐす）<BR> 0.5%NP40/PBSで30min incubate（ovarioleを覆う膜をおおざっぱにのぞく）<BR> PBSでwash<BR> 8%NGS/PBTw で室温30min<BR> 一次抗体（室温1~2hr）<BR> ・・以下同様<BR> <BR> というようにやりました（おおざっぱというところが苦しいですが・・）。<BR> 中村さんのプロトコールではdetergentが弱いような気がします。<BR> 固定後に強いdetergentで処理してはいかがでしょうか？<BR> また、obarioleを覆う膜がぴったりくっついているとそこのegg chamberだけが全く<BR> 染まらないということがあります。かといって膜を完全にのぞくとその後の<BR> 染色がやりずらいので、egg chamberが切り離されない程度に膜をのぞくorほぐしま <BR> した。<BR> 膜の中に抗体が入るようにすることが重要だと思います。<BR> <BR> と偉そうなことを書きましたが、私もちょっとやってみた程度なのでもっと良い方法が<BR> あるかもしれません・・。<BR> <BR> ====================================<BR> Makoto Sato (Kornberg lab)<BR> University of California, San Francisco,<BR> Dept. of Biochemistry, Box0448<BR> HSE 1570, 513 Parnassus,<BR> San Francisco, CA 94143, USA<BR> Phone: 415-476-4963<BR> Fax: 415-476-3892<BR> E-mail: makotosアットマークitsa.ucsf.edu<BR> satoumaアットマークpo.jah.ne.jp<BR> ====================================<BR>